本篇目录：
- 1、western一抗室温下孵育,还能回收么
- 2、wb一抗孵育时间
- 3、wb实验中一抗和二抗的作用
- 4、wb二抗室温几小时
- 5、westernblot结果不好,可以把一抗洗脱下来后再2次孵育吗?
- 6、western蛋白样品最多可以反复冻融几次?
western一抗室温下孵育,还能回收么
1、该情况下抗原可以回收。当一抗在37度孵育时间过长时，虽然抗体仍然能够回收，但会对实验结果产生一些影响。长时间的高温孵育会导致抗体的部分失活，从而降低其与抗原的结合能力。
2、不能。一抗的孵育时间与温度、抗体浓度有关。一般情况下，在37℃的条件下，孵育1-2小时左右。在室温的条件下，孵育3小时左右。在4℃的条件下，孵育18-24小时左右。
3、在室温的条件下，孵育3小时左右。在4℃的条件下，孵育18-24小时左右。如果一抗的浓度过高或者是孵育时间过长，会导致非特异性吸附，增加洗涤的难度，最终因洗涤不彻底而出现非特性显色。
4、最常见的是使用来自两个物种的一抗，比如鼠和兔，在一抗孵育时同时加入，二抗时同时加入针对一抗产生物种特异带有不同荧光素的二抗就可以。一抗依旧可以回收，只不过下次用还是可以同时探测到两种蛋白。
5、（1） 参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。（2）用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。（3）回收二抗。
wb一抗孵育时间
一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，4度过夜（从冰箱拿出后37度复温45min）。具体条件还要摸索。
WB一抗孵育时间是指在实验室中进行Western Blot实验时，首次将抗体与蛋白质进行反应的时间。该时间决定了Western Blot实验的有效性和准确性。因此，掌握适当的孵育时间非常重要。
不可以。一抗是4度，孵育过夜16-20小时即可。孵育过久，会出现非特异性的条带。一抗的孵育时间与温度、抗体浓度有关。通常情况下，在37℃的条件下，孵育1-2小时左右。
在室温的条件下，孵育3小时左右。在4℃的条件下，孵育18-24小时左右。如果一抗的浓度过高或者是孵育时间过长，会导致非特异性吸附，增加洗涤的难度，最终因洗涤不彻底而出现非特性显色。
一抗的孵育时间与温度、抗体浓度有关。一般情况下，在37℃的条件下，孵育1-2小时左右。在室温的条件下，孵育3小时左右。在4℃的条件下，孵育18-24小时左右。
western blot 一抗孵育4小时当然有影响的，一抗孵育时间太长容易导致非特异性吸附加深 一般可以室温孵育三十分，然后四度过夜。或者选择室温孵育2小时直接二抗。因为洗膜洗去的是未结合的抗体，抗体结合上就不容易洗掉了。
wb实验中一抗和二抗的作用
WB一抗二抗是乙肝病毒感染的免疫学检测方法。WB是Western Blotting的缩写，即蛋白印迹技术，可以检测人体内是否存在抗乙肝病毒的抗体。一抗是指检测乙肝表面抗原（HBsAg）的抗体，二抗是指检测乙肝表面抗体（HBsAb）的抗体。
之所以用二抗，是因为二抗是带有酶标的抗体，它跟一抗结合之后可以曝光显影。如果你的一抗上面直接带有酶标物，那可以不用二抗直接曝光。但是一般你的一抗都是少数应用的，厂家不会大批量生产，就不会费劲给它加酶标。
一抗：可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。二抗：可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记（如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。
WB检测的基本原理不做细述，可根据以下图片脑补一下：WB实验中使用到的有三种抗体：一抗、二抗和内参抗体。
wb二抗室温几小时
1、WB实验中，二抗孵育的时间通常为37℃1-2h。不过要注意，具体的孵育时间可能会根据实验条件的不同而有所变化，如抗体浓度、孵育温度等。在确保实验结果良好的情况下，建议根据具体情况对孵育时间进行适当调整。
2、二抗一般室温就行，没要求要37度，一个小时差不多就够了。蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。
3、度1h，二抗浓度不要过高，否则，背景颜色太深，还可能出现非特异条带。
4、二抗一般室温或37度30min-1h，浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。
5、可以**，二抗在4度环境下孵育一个小时是可以的。不过，具体的孵育时间要根据实际情况进行优化和调整，如孵育温度、抗体浓度以及具体的实验需求等。
6、不可以。参考二抗的说明书，按照适当比例用封闭液稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，二抗孵育时间为1至2小时，吸尽洗涤液后，立即加入稀释好的二抗，室温在摇床上缓慢摇动孵育，回收二抗。
westernblot结果不好,可以把一抗洗脱下来后再2次孵育吗?
清除一抗后，可以重新孵育二抗。在二抗孵育之前，需要确保一抗已经被完全清除，否则可能会出现非特异性条带或背景问题。
没有问题的。我这样做过，电泳没问题的话能够显出条带的，但整体亮度要弱些。
用抗体剥离液，第一次的抗体剥掉，再孵育第二次的抗体。这种方法需要对剥离的结果进行分析后再做，防止未能完全剥离干扰第二次实验的效果。
理论上来说是可以的，网上也看到有网友声称自己这样做过。但是不同种一抗是否兼容不相互影响，各自应该加多少量这些条件都需要特别摸索优化。
轻轻拔去梳子，第一孔加入5ul预染的蛋白maker ，2~7孔依次加入20ul待测蛋白样品，第8孔加入10ul提前融化的loading buffer。上样时轻轻加入，注意不要将样品加入其他孔，或加样过快导致样品溢出。
可以。WB封闭后可以隔天再敷一抗，因为在生物化学研究中，Western Blot是一种常用的蛋白质分析技术。在Western Blot实验中，封闭液是为了减少膜上未结合的活性基团，封闭剂通常含有BSA，也可以使用羊血清蛋白。
western蛋白样品最多可以反复冻融几次?
1、蛋白尽量不要反复冻融，否则对你的结果会产生影响。你可以先分装，每个离心管里装你每次实验所需要的量。做一次实验，拿出来一个样品就行了。
2、抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。
3、为了确保DNA的完整性和实验结果的准确性，反复冻融的次数限制在3-5次。这可以减少对DNA分子的损伤，还可以降低实验操作的风险。
