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如何检测蛋白是否发生磷酸化
1、目前研究蛋白质磷酸的方法有放射性同位素标记、生物质谱分析等多种方法。
2、WesternBlot 利用SDS-PAGE分离生物样品，随后转移到膜上（通常是PVDF或尼龙膜），之后利用磷酸化特异的抗体来鉴定目的蛋白。
3、磷酸化抗体可以识别蛋白质的磷酸化或者非磷酸化形式，而且可以在避免放射污染的情况下，对磷酸化蛋白进行定性和定量分析，因此特异性磷酸化抗体是研究蛋白质磷酸化的重要工具。
磷酸化蛋白WB究竟注意哪些条件
磷酸化蛋白WB有很多注意条件 比如：一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使条带压出来也会很浅，结果也不可信。加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间。
注意：避免蓝色条带跑出分离胶，这样有可能目的蛋白也已经跑出，所以在分离胶底部出现一条整齐水平的蓝色条带时，即停止电泳。 Little Trick 电泳时插好正负极后，从电泳槽底会有小气泡上升，气泡的数目和上升速率与电压大小呈正比。
第二，磷酸化蛋白提取蛋白的时候，最好加入原钒酸钠，和磷酸酶抑制剂，防止蛋白脱磷酸化。第三，不要用牛奶做封闭剂，用BSA。因为牛奶中含有磷酸化酪蛋白，防止非特异带。
磷酸化 蛋白WB，提取蛋白时不加磷酸酶抑制剂会有影响，大不大要看具体的实验结果 不加磷酸化抑制剂也可以做磷酸化蛋白WB，但是有可能会影响具体的实验结果，大部分时候不加磷酸化抑制剂也能得到结果的。
必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性。
磷酸化抗体和普通抗体的选择?
1、普通抗体一般都是检测总蛋白，会出现一条以上的条带。但也有特例，如果抗原表位在磷酸化位点周围，那么抗磷酸化的抗体只能检测磷酸化底物，而普通抗体也只能检测非磷酸化底物。
2、磷酸化抗体合成：人工合成含磷酸化位点的多肽-〉人工体外磷酸化-〉链接半抗原-〉免疫动物-〉收获抗体。磷酸化的蛋白很大部分是转录相关因子。因此使用磷酸化抗体和普通抗体。
3、通常来说，磷酸化抗体芯片上检测某一个磷酸化位点会设置一对抗体，即：磷酸化的和非磷酸化的抗体。说到区别，可能从制备讲起你可以更加清晰一些。
4、首先肯定是因为CST是磷酸化抗体起家，在修饰性抗体这种特异性灵敏性要求很高的抗体中占有绝对的领导地位。其次CST提供的磷酸化抗体，品质高，全球公认的好。而且CST的服务态度和服务质量很高，会提供抗体具体使用条件说明书。
