荧光抗体的纯化,荧光抗体染色技术

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1、免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。

2、这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术(fluorescentantibodytechnique)。荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。

3、ELISA基本原理 ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。

1、双标记法用不同的荧光素分别标记不同的抗体，对同一标本染色，检测两种相应的抗原。

2、间接免疫荧光抗体技术标记抗体，可用已知抗原检测第一抗体，同时也可用已知第一抗体检测未知抗原。分别用两种荧光素标记两种第一抗体，可同时检测两种抗原。直接法将荧光素标记在第一抗体分子上，只能检测抗原分子。

3、免疫荧光双染是一种在很多医院和实验室常用的一种生物化学检查方法，存在的意义是使用携带有不同颜色荧光标记物的抗体对同一样本中的两种不同抗原进行区分和定位。重免疫标记法可以分为直接发和间接法。

荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。

荧光抗体技术是以荧光物标记抗体进行抗原定位的技术。本技术较其他鉴定细菌的血清学方法有速度快、操作简单、敏感性高等特点，它在临床检验上已用作细菌、病毒和寄生虫的检验及自身免疫病的诊断等。

免疫荧光技术（Immunofluorescence technique，IF ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。

免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种，是将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。

1、首先，他们考虑在重组蛋白上加入短肽标签(tag)，当时市面上已有 myc、flag、KT3 epitope 等标签，但这些主要适用于侦测目标蛋白，纯化蛋白效果非常有限，或非常昂贵。

2、款曲线，解决99% 的ELISA 数据拟合难题我问师兄怎么纯化包涵体，他说……我问师兄如何让蛋白纯度更高，他只告诉我这点……硬核 | 细胞培养笔记猜想大家可能都有过这种经历，导师要求你在实验室建立一个新的实验方法。

3、因此在温和的纯化流程中可以产出高纯度（纯度 95%）、高产量的目标蛋白，且能保持目标蛋白活性。

4、以下的实验是为了最大化将组氨酸位点蛋白结合到金属螯和柱料，然后确保能够洗脱下来。当结合和洗脱的条件尚未明了时，这些方法也是很好用的。为了获得高纯度的蛋白，必须摸索咪唑的缓冲液在样品上柱和洗脱时的浓度。

5、在用酶标板加样的时候，蛋白样品常常会产生很多气泡，如果做荧光实验，由于灵敏度非常高，一点点微小的气泡都会影响很大，常常又不可能加消泡剂，我就用卫生纸，撕下来一小条，搓成小针，碰一碰气泡就破了，很好使。

采用什么样的纯化方式取决于对引物纯度要求的高低。一般来讲，普通PCR和荧光定量（Q-PCR）使用PAGE纯化已经足够。但如果做复合PCR，则对引物纯度要求更高。

由于qpcr属于定量分析，必须要求引物纯度高。所以必须用HPLC纯化。

如果是用于定量PCR的探针，建议使用PAGE纯化，或者HPLC纯化。

1、ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。

2、ELSIA用于抗原或抗体含量及理化性质的检测，适用于临床方面血清等。免疫荧光法是检测有没有抗体，根据已知抗原（或抗体）推知另一个未知的抗体（或抗原）。适用于细菌、病毒、衣原体、支原体等病原体。

3、三种SHIV感染性分子克隆体外转染293T细胞，在不同的时间点采样，通过实时荧光定量RT-PCR和ELISA两种方法监测SHIV病毒复制过程。

4、反应不同：WB可以反映出分子量的信息，ELISA不能。WB一般只能做到半定量，ELISA一般可以定量。检测不同：基因翻译蛋白质， PCR可以检测基因的表达量，绝对定量和相对定量。