本篇目录：
wb跑内参和目的蛋白区别
是看提取蛋白质量的好坏。如果做western的时候，内参照蛋白有条带，而目的蛋白没有，说明蛋白的提取和转膜等步骤没有问题，是目的蛋白的抗体质量不好或者是稀释倍数不对。
通过将目标蛋白的信号强度除以内参的信号强度，可以得到一个相对的信号值，从而消除了不同样品之间的差异，使得实验结果更加可靠和可比较。
普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。
内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。
在抗体实验中内参如何使用?
western blot实验中，完成电泳及电转膜之后，转完后将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。
在WB实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。
作为空白对照，检测WB过程中蛋白转膜是否完全以及发光显色体系是否正常。内参就是标准品，是对照。
Blotting实验过程中使用内参的方法有：超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。
例如，在western blot实验中，内参可以是乳腺癌细胞中常见的丰度相对稳定的蛋白质如β-actin或GAPDH。
wb中一抗和内参怎么加的
1、内参配制方法：WB操作简单，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应是比较复杂的，因此用来测定表达产物时存在着一定的不确定性。
2、配制actin一抗( 公司)，1：2000稀释，加入上述配制的5%牛奶4ml，再加入2ul actin一抗，混匀，现配现用。 将PVDF膜从封闭液中取出，可用平头镊子小心放入塑料手套的手指中，加入一抗，封口，使膜完全浸泡在一抗中，放入冰箱，4℃过夜。
3、WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将混合蛋白质样品分离后，利用特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（例如PVDF膜）上。
4、蛋白测定之后要加5X SDS上样缓冲液，该怎么加呢？是所有的标本一起加了，还是就算准备上样的量？经中心试验室CWW指点后才知道，可以一起加了。就是把蛋白样品的体积除以4就是了，这样的5Xbuffer就变为了1X。
5、置膜于25ml封闭缓冲液中1h，室温，摇动。 15mlTBS/T洗3次(5min/T)。 加入合适稀释度的一抗，室温孵育1-2h或4°C过夜，缓慢摇动。 15mlTBS/T洗3次(5min/T)。
