本篇目录：
- 1、western膜能否同时孵多种抗体
- 2、western如何孵一抗
- 3、wb一抗孵育时间
- 4、western封闭膜以后,不能马上孵育一抗,把膜放在4度环境下,2天,行吗??
- 5、杂交袋如何抗体孵育
- 6、western一抗室温下孵育,还能回收么
western膜能否同时孵多种抗体
1、理论上来说是可以的，网上也看到有网友声称自己这样做过。但是不同种一抗是否兼容不相互影响，各自应该加多少量这些条件都需要特别摸索优化。
2、做两个一抗好像失去了意义。western-blootting本身就是为了鉴别区分，何不分开来做。再者，如果用两个一抗，如何进行反应，确实需要多次试验摸索，那个麻烦劲，还不如索性分开做简单。
3、多抗做Western blot的时候出现杂带可能是由于以下原因：弱交叉抗反应：当多个抗体同时与蛋白质结合时，可能会导致某些抗体出现同位素交叉反应，导致出现杂带。通常发生在稀释比较高或者抗体浓度较高的情况。
4、需要注意的是，如果一抗和二抗是不同的物种特异性抗体，那么在重新孵育二抗之前，需要确保一抗和二抗不会发生交叉反应。否则，可能会出现非特异性条带或背景问题。
western如何孵一抗
1、按照所用抗体说明书，用TBST按说明书建议比例稀释一抗进行孵育，因抗体都很珍贵，一般用量在稀释后2-5毫升即可，用封膜机进行封膜孵育。
2、（2）用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果 不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。（3）回收一抗。
3、可以 封闭是为了阻碍抗体非特异性与膜结合。如果封闭液是牛奶的话泡两天会变臭吧~可以把膜泡在TBS中。两天以后 重新封闭就可以了。这样可能会导致蛋白条带有一点扩散，也会损失一些蛋白。但是对最后结果影响不大。
4、在sds-page电泳前，一般样品加入上样缓冲液中并煮沸5~10分钟，让蛋白样品变性并带上一定电荷，使蛋白迁移速度只与分子量相关，这样才能将不同的蛋白通过电泳尽量的区分开来。
5、（1）配制一抗：按照一定比例稀释抗体，并将配好的抗体置于夹链袋中。（2）裁膜：将NC膜多余的部分裁去。
6、最常见的是使用来自两个物种的一抗，比如鼠和兔，在一抗孵育时同时加入，二抗时同时加入针对一抗产生物种特异带有不同荧光素的二抗就可以。一抗依旧可以回收，只不过下次用还是可以同时探测到两种蛋白。
wb一抗孵育时间
1、通常情况下，在感染后4-6周，体内便会产生抗体，但有时可能需要更长的时间（可能长达3个月）才能产生足够的抗体以供检测。因此，通常建议在感染后3个月后进行一次HIV抗体检测，以确保测试结果准确无误。
2、不可以。一抗是4度，孵育过夜16-20小时即可。孵育过久，会出现非特异性的条带。一抗的孵育时间与温度、抗体浓度有关。通常情况下，在37℃的条件下，孵育1-2小时左右。
3、WB一抗孵育时间是指在实验室中进行Western Blot实验时，首次将抗体与蛋白质进行反应的时间。该时间决定了Western Blot实验的有效性和准确性。因此，掌握适当的孵育时间非常重要。
4、一抗的孵育时间与温度、抗体浓度有关。一般情况下，在37℃的条件下，孵育1-2小时左右。在室温的条件下，孵育3小时左右。在4℃的条件下，孵育18-24小时左右。
western封闭膜以后,不能马上孵育一抗,把膜放在4度环境下,2天,行吗??
1、在四度冰箱中可以的，拿出来后一抗多洗一会没事的，不然可能会背景有点深，我最长敷过四天呢，妥妥的。
2、-2周。此外，在收到抗体后，也可暂时 保存至4℃冰箱中 ，短期保存时间为1-2周。 也有一小部分抗体适合长期保存于4℃冰箱。
3、正常情况，室温封闭1h即可。如果曝光背景过高，可以适当延长封闭时间至2-5h，也可以4℃过夜， 封闭时间过长并不会导致检测信号减弱 。如果延长了封闭时间，背景还是高。
4、western blot 一抗孵育4小时当然有影响的，一抗孵育时间太长容易导致非特异性吸附加深 一般可以室温孵育三十分，然后四度过夜。或者选择室温孵育2小时直接二抗。因为洗膜洗去的是未结合的抗体，抗体结合上就不容易洗掉了。
5、但是会对结果有一定影响。就像楼上说的，孵育过抗体再晾干就不能strip了，一般stripping 试剂盒说明书都有强调这个。如果要保存膜可以浸泡在PBS或TBS中，4度放置。注意：上过抗体的膜最好不要晾干，可能会导致无法Strip。
杂交袋如何抗体孵育
一抗是用封闭液稀释的，二抗用TBST；AB液1：1混合后即可；封闭液直接买的现成品，不贵，效果也很好；抗体孵育的时候用杂交袋，可以减少抗体的用量；显影定影用国产几块一包的即可。封闭液是PBST配置的5%脱脂奶粉。
一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。结合二抗：根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释(1：1000~1：10000)，室温轻摇一小时。
(五) 免疫反应(个人建议：还是使用杂交袋进行一抗和二抗的孵育，节约抗体)(1) 将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
一抗的用量要根据你的抗体的质量来看的，在抗体的说明书上一般都有推荐的浓度，刚开始可以做个中间的浓度摸下条件。在短期内一抗可以反复使用的，所以放在杂交袋中方便回收使用。
首先，将抗体滴于小片滤纸上，再将滤纸放入杂交袋中并将其封合。接下来，将杂交袋放入恒温孵化箱中，在适当的温度和时间条件下进行孵育。最后，将杂交袋取出，拆开杂交袋并去除滤纸，即可得到经过抗体孵育的实验材料。
western一抗室温下孵育,还能回收么
（2）用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果 不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。（3）回收一抗。
一抗不能放在室温，会立马失活。一抗的孵育时间与温度、抗体浓度有关。一般情况下，在37℃的条件下，孵育1-2小时左右。在室温的条件下，孵育3小时左右。在4℃的条件下，孵育18-24小时左右。
我一般用封口膜做成小盒，置于大玻璃平皿中，放入PVDF膜，用枪从上到下向膜上加一抗，完全浸没，之后和PCR上样仪一同固定在摇床上，4℃孵育过夜。 次日，回收一抗，做好标记，-20℃保存，可再使用3~4次。
不能。一抗的孵育时间与温度、抗体浓度有关。一般情况下，在37℃的条件下，孵育1-2小时左右。在室温的条件下，孵育3小时左右。在4℃的条件下，孵育18-24小时左右。
最常见的是使用来自两个物种的一抗，比如鼠和兔，在一抗孵育时同时加入，二抗时同时加入针对一抗产生物种特异带有不同荧光素的二抗就可以。一抗依旧可以回收，只不过下次用还是可以同时探测到两种蛋白。
