酵母展示抗体筛选-酵母展示抗体库构建

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靶向CHO细胞关键调节基因，通过基因工程手段改造和驯化产生CHO细胞亚系，使表现出更好的凋亡抗性、代谢、糖基化、蛋白表达、细胞周期调节、增殖、分泌或细胞骨架动力学。

稳转细胞株构建选择宿主细胞系：选择能够稳定承载外源基因的细胞系作为宿主细胞。常用的细胞系包括HEK29CHO、HeLa等。构建表达载体：设计和构建包含目标基因的表达载体。

验证细胞稳定性和表达在细胞筛选和扩展完成后，需要验证构建的细胞稳定性和表达情况。这可以通过多种方法实现，例如荧光染色、Western blotting等。

1、酵母单杂交原理：将已知的顺式作用元件构建到最基本启动子(minimal promoter，Pmin)上游，把报告基因连接到Pmin下游。

2、备注1：该酵母文库可以选择增加均一化处理步骤，我们使用DSN法均一化方法，可以构建出高质量的均一化酵母杂交文库，可以大大减少后续酵母筛选的工作量和筛选效率等。

3、最近在做龙须菜高温胁迫表达cDNA文库的构建，选择的是CaM做诱饵质粒构建表达载体pGBKT-CaM，利用SMART技术将重组质粒转化到酵母菌Y187中，搜集了部分资料找到了一份比较全的酵母双杂交实验操作步骤。

4、利用 cDNA 第一链的 3 末端常常出现发夹环的特征，这种发夹结构是反转录酶在第一链末端“返折”并且进行复制第一链的结果，用这种方法合成的双链 cDNA 在一端有一个发夹环，可以用单链特异的 S1 核酸酶切去。

5、⑷ 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。

6、构建基因组文库的步骤A 分离基因组DNA；B 用超声波或限制酶等进行基因组DNA部分或完全降解；C 将降解物进行分级得到所需大小DNA片段；D 将DNA片段与载体连接(一般用λ噬菌体载体)；E 将重组体导入宿主细胞；F 最后筛选鉴定重组子克隆。

1、在构建基因文库时，不同的重组噬菌体DNA经过裂解生长过程最终形成大量的噬菌斑，这些噬菌斑的集合，就构成了基因文库，用λ噬菌体载体构建基因文库时，文库是以噬菌斑的形式存在的，而质粒载体构建的文库是以菌落的形式存在的。

2、应用噬菌体展示技术的关键是构建表达性基因文库，这种文库称为噬菌体展示文库(phage display library )。常用的构建噬菌体显示文库的表达载体有两类：丝状噬菌体和以这些噬菌体复制起始序列为基础构建的噬菌粒(phagemid)。

3、单链丝状噬菌体展示系统（1）PⅢ展示系统。丝状噬菌体是单链DNA病毒，PⅢ是病毒的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒的尾端，是噬菌体感染大肠埃希菌所必须的。

备注1：该酵母文库可以选择增加均一化处理步骤，我们使用DSN法均一化方法，可以构建出高质量的均一化酵母杂交文库，可以大大减少后续酵母筛选的工作量和筛选效率等。

具体实验步骤如下：构建酵母表达载体：将含有自身复制元件2μ、酵母转录起始序列、选择性筛选的标记基因等元件的酵母表达载体与感兴趣的蛋白质基因融合，在表达载体中得到融合基因。

酵母双杂交法的原理：典型的真核生物转录因子，如GALGCN等都含有二个不同的结构域： DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。

选择适当的酵母双杂交系统：常用的酵母双杂交系统包括Gal4系统和LexA系统。选择适合你实验需要的系统。设计诱饵序列：诱饵是你感兴趣的蛋白质，可以是全长蛋白或其特定区域。

酵母双杂交系统是一种生物化学技术，用于研究两种蛋白质之间的相互作用。

1、CDR与抗原结合过程受到FR区域的影响，动物源CDR与人源Fr结合，可能会改变抗体原有CDR的空间结构，进而降低重组抗体与抗原的亲和力。

2、一般我们使用还原性和非还原性电泳检测重组抗体，如果客户需要验证抗体的特异性，需提供额外抗原使用WB检测。我们使用哺乳动物细胞表达获得重组抗体，我们只承诺蛋白序列与设计相符，不承诺重组抗体具有客户预期的生理活性。

3、基因工程抗体又称基因重组抗体，即在充分认识Ig的基因结构和功能基础上，应用DNA重组和蛋白质工程技术，按需要在基因水平上对编码Ig分子的基因进行切割、拼接与修饰等，并导人受体细胞，使之表达出新型抗体分子。

4、抗体(antibody)是指机体由于抗原的 *** 而产生的具有保护作用的蛋白质。

5、嵌合IgG抗体目前嵌合抗体的研究主要集中在嵌合IgG(Immunoglobulin G)抗体。