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慢病毒颗粒聚集的原因
1、） 含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。2） 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。3） 培养 48hrs – 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。4） 病毒的纯化和浓缩。
2、感染时间 病毒感染的时间建议不能过短，病毒感染的时间太短，病毒没有侵入到细胞内部。如果感染细胞的时间过长，没有及时换液也会导致细胞状态差。通常需要感染24 h后换液，48 h-72 h观察荧光。
3、原因有运行时间长。运行时间长：随着滤膜运行时间的增加，滤膜中的污垢和微生物会越来越多，这些污垢和微生物可能会在滤膜表面聚集，最终形成颗粒堆积。
4、病毒包装的原理，就是有遗传物质有外壳蛋白，在细胞内可以指导二者包成病毒。
5、在慢病毒感染后，细胞破碎通常有两个 原因 ： a、慢病毒使用量过多，或细胞数量过少；b、支原体污染。 由于轻度的支原体污染并不影响细胞的生长增殖，故支原体污染被许多实验室所忽略。
6、Polypene 的选择：Polypene 是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polypene 能提高感染效率2～10倍。
shRNA真核表达载体构建的原装进口shRNA表达系统
1、此shRNA数据库亦有一套原装进口的shRNA表达系统相匹配，针对每个基因的一套shRNA序列均已构建至相应的shRNA表达载体上，可直接使用，整套产品均为原装进口。
2、构建的shRNA真核表达载体或者mirshRNA真核表达载体，由于载体上均带有LR同源重组臂，所以这些载体均可作为YRBIO腺病毒包装系统中的穿梭载体使用。
3、第1版的TRC shRNA文库包括35，000 shRNA克隆（其中人类基因有5300个，小鼠基因有2200个），其它新构建的克隆每个季度会陆续公布。
4、shrna敲低原理如下：shrna主要是由于互补配对诱发同源mrna特异性降解。将shrna构建到plko.1的质粒中，将质粒转染进细胞，在细胞质中，质粒就是转录出一段与目的基因互补的单链rna。
5、shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，几个基因有一段核苷酸序列重叠在一起。重叠基因中不仅有编码序列也有调控序列，大基因内包含小基因。
lncRNA过表达到底能不能用慢病毒
1、构建 lncRNA 过表达质粒或者慢病毒、腺病毒包装载体。原则上是将全长lncRNA 定向克隆到表达载体上实现 lncRNA 的过表达。然而有些 lncRNA很大或全长尚未分离，这时将视 lncRNA 在基因组上的定位采取不同的研究策略。
2、上面介绍的pcDNA1和PX458均是瞬时表达载体并不能在人类等细胞中进行复制，随着细胞的分裂，单个细胞中的质粒不断的被稀释，因此这些载体只能起到瞬时表达的效果。
3、因为F和R端是全长的两端。因此需要设计出所需要的酶切位点 ，这个可以根据自己的载体来确定。
4、通过载体实现lncRNA的过表达原则上将全长lncRNA定向克隆到表达载体上实现。可以选用载体有：可以修饰的启动子载体，一般如cmv； pcDNA1 等。
